Utilizar correctamente los tampones en la PCR es tan importante como utilizar una buena taq polimerasa.
El papel de KCl:
El KCl facilita la extensión del complejo Primer-DNA. El ion K+ de la KCl se une la cadena fosfato-azúcar del ADN (igual que Mg2+). Esta unión disminuye la repulsión electrostática entre los cebadores y la cadena diana de ADN. Así que facilita la correcta unión de los cebadores con la cadena complementaria de ADN y la temperatura que se establece para el “annealing” será menos decisiva para que la polimerasa pueda comenzar a añadir nucleótidos.
En PCR largas se recomienda una menor concentración de KCl porque se ha demostrado que a altas concentraciones de KCl las cadenas largas de ADN son más “reluctantes” a separarse, es decir, se desnaturaliza a un ritmo más lento que el ADN de corta duración.
Hay fabricantes que incluyen buffers diferentes en sus taq polimerasa para optimizar las condiciones de PCR e incluso para aprovechar el efecto combinatorio de KCl y (NH4)2SO4. En esta combinación los iones K+ se unen a cadena fosfato-azúcar del ADN del fosfato donde se encuentra el NH4+ tanto en su forma iónica como amoníaco que interactúa a través de enlaces de hidrógeno. Estas interacciones pueden ayudar a desestabilizar los débiles enlaces de hidrógeno entre bases no complementarias durante el annealing. Este papel combinado, ayuda en la unión especifica de los cebadores con la cadena de ADN complementaria, en un amplio rango de temperaturas.
El papel de MgCl2:
La concentración de iones de magnesio puede afectar a la especifidad y eficiencia de la reacción y, por lo tanto, se identifica como un componente crítico.
La enzima Taq polimerasa requiere que el cofactor Mg2+ inicie la reacción catalítica y funcione eficientemente.
Los dNTPs y los oligonucleótidos (cebadores, primres) se unen a Mg2+, por lo tanto, su concentración debe ser superior a la concentración molar de los grupos fosfato presente tanto en los dNTPs como en los cebadores. Los dNTPs se unen en concentración equimolar con el Mg2+. Los agentes quelantes como el (EDTA) y los iones cargados negativamente de los tampones donde está disuelto el ADN diana también pueden retener iones de Mg2+. Todo eso se tiene que tener en cuenta cuando se prepara la PCR.
La enzima polimerasa es más activa a concentraciones altas de Mg2+ pero tiene menor “fidelidad”, es decir, la enzima es más propensa al error a concentraciones excesiva de Mg2+. La concentración de iones de magnesio se puede reducir, de modo que las polimerasas apenas sean procesivas (Enzima procesiva: que puede llevar a cabo rondas de catálisis sin disociarse de la cadena molde de DNA) . Esto dará lugar a una mayor fidelidad de amplificación.
La concentración de Mg2+ depende de las proporciones empíricas de los primers y el ADN diana y tendrá que estandarizarse para cada experimento. Se ha estudiado que la actividad más alta de la polimerasa se da a concentraciones de Mg2+ entre 1,2 a 1,3 mM. Es por esto que los búferes PCR estándar contienen 1,5 mM de MgCl2.
En resumen:
En la PCR es fundamental la presencia de cationes divalentes.
La concentración de MgCl2 en la mezcla final de reacción suele estar entre 0,5 y 4,0 mM, y la concentración óptima se determina empíricamente
Los iones Mg2+: forman un complejo soluble con los dNTP, lo cual es fundamental para la incorporación de estos; estimulan la actividad polimerásica; aumentan la Tf (temperatura de fusión) de la interacción cebador/ADN molde (con lo que estabilizan la interacción entre las dos cadenas).
Generalmente, una concentración baja de Mg2+ provoca un rendimiento bajo (o incluso nulo), mientras que una concentración elevada de Mg2+ hace que se acumulen productos inespecíficos.
Como usar correctamente los tampones en la PCR
IBIAN Technologies ha optimizado sus bufferes de PCR y ofrece en todas sus polimerasas 3 bufferes diferentes y un tubo de MgCl2 para la optimización de la PCR.
Nuestros consejos son:
Si lo que necesitas es la máxima sensibilidad, recomendamos el tampón “Complete KCl” (tubo tapón negro).
Para PCR en tiempo real (con sondas Taq Man y sybr green) y alta sensibilidad, aconsejamos usar el búfer KCl pero añadiendo MgCl2 (tubo con tapa verde) a una concentración final de 2-3 mM. (Esto significa que tiene que añadir 0,5 -1,5 mM de MgCl2 a la concentración de nuestro buffer KCl complete que como sabe tiene una concentración de 1,5 mM de MgCl2)
Para PCR en tiempo real con SYBR Green usar el tampón “Complete KCl”. (tubo tapón negro) pero añadiendo MgCl2 (tubo tapón verde) a una concentración final de 2,5- 3 mM de MgCl2 Descarga nuestra plantilla para preparar tu master-mix con SYBR Green
El tampón Complete NH4 (tubo con tapa amarilla) se puede utilizar si el tampón KCL suplementado con MgCl2 no da resultados satisfactorios.
Para optimizar las condiciones de PCR, recomendamos mezclar los dos tampone “Complete KCl” (tubo con tapa negro). y “Incomplete NH4” (tubo con tapa rojo) en una proporción de 1: 1 y ir añadiendo MgCl2 a una concentración creciente hasta un máximo de 4 mM MgCl2
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