Separación de linfocitos en gradiente de densidad

PanColl

Sedimentación isopínica es la técnica que permite separar células en función de su densidad. Este método es ideal para separar células cuyas densidades difieren en más de 0,02 g/ml.

La separación se consigue haciendo sedimentar las células en un gradiente de densidad, es decir, en un medio cuya densidad aumenta con la profundidad del tubo.

El medio con el que se forma el gradiente de densidad debe ser muy soluble en agua para poder abarcar un amplio rango de densidades. Además debe ser: inerte, no debe ser tóxico, no debe ser viscoso a concentraciones elevadas y no debe ejercer mucha presión osmótica en disolución.

Ejemplos de este tipo de medios son la sacarosa, el cloruro de cesio, metrizamida y polímeros de elevado peso molecular como los dextranos, el Ficoll o el Pancoll.

En este artículo nos centraremos en el uso de las soluciones de separación Pancoll.

Las soluciones de separación Pancoll que comercializamos, contienen un polisacárido con un peso molecular de 400.000 daltons. Este polímero hidrófilo permite la producción de soluciones acuosas para la separación celular con una densidad de hasta 1,119 g/ml.

Hay diferentes referencias de Pancoll que ofrecen una variedad de soluciones listos para usar con una densidad que va de 1.063 g / ml hasta 1.119 g / ml y que se pueden utilizar para una amplia gama de aplicaciones de separación celular.

Como las densidades de las fracciones sanguíneas y la osmolalidad son diferentes entre las especies, estos parámetros se optimizan en Pancoll para sangre humana, de rata, ratón y otras especies.

En particular en este articulo nos centraremos en el Pancoll para sangre humana.

La densidad es el parámetro clave para elegir la solución adecuada para la fracción objetivo (ver tabla 1).

Tabla 1: Densidad de las fracciones celulares de la sangre humana

Fracción celularDensidad [g / ml]
Trombocitos1,040-1,060
Monocitos1.059 – 1.068
Linfocitos1.066 – 1.077
Basófilos1.075 – 1.081
Neutrófilos1.080 – 1.099
Eosinófilos1.088 – 1.096
Eritrocitos1.090 – 1.110

Si se usa Pancoll human 1.077, todas las fracciones con densidades más altas (como se indica en la tabla anterior, que son basófilos, neutrófilos, eosinófilos y eritrocitos) migrarán al fondo del tubo de centrifugación. En este caso, la fracción purificada contiene concentrados de linfocitos, monocitos y trombocitos, incluyendo también trazas de basófilos debido a su rango de densidad. Por consiguiente, Pancoll human 1.068 es adecuado para aislar monocitos y trombocitos. Para aislar granulocitos recomendamos comprar Pancoll human 1.077 y Pancoll granulocitos 1.119. Debido a la agregación de eritrocitos inducida por el medio Pancoll, se pueden aislar granulocitos de los glóbulos rojos.

Pancoll

Separating solutions

ProductoDescripciónReferenciaTamaño
Pancoll humanSeparating Solution, Density: 1.077 g/mlP04-60100
P04-60500
100 ml
500 ml
Pancoll proSeparating Solution, Density: 1.077 g/ml;Low endotoxin (<0.1 EU/ml)P04-60105
P04-60505
100 ml
500 ml
Pancoll animalSeparating Solution, Density: 1.077 g/mlP04-63100
P04-63500
100 ml
500 ml
Pancoll mouseSeparating Solution, Density: 1.086 g/mlP04-64100
P04-64500
100 ml
500 ml
Pancoll ratSeparating Solution, Density: 1.091 g/mlP04-65100
P04-65500
100 ml
500 ml
Pancoll PlateletsSeparating Solution, Density: 1.063 g/mlP04-67100
P04-67500
100 ml
500 ml
Pancoll monocytesSeparating Solution, Density: 1.068 g/mlP04-68100
P04-68500
100 ml
500 ml
Pancoll humanSeparating Solution, Density: 1.100 g/mlP04-69610
P04-69600
100 ml
500 ml
Pancoll granulocytesSeparating Solution, Density: 1.119 g/mlP04-60110
P04-60150
100 ml
500 ml

in combination with Pancoll human density: 1.077 g/ml

Separación de linfocitos

Para la separación de linfocitos se utiliza sangre que se ha desfibrinada o tratada con anticoagulantes (Heparina, EDTA, Citrato), y que se diluye de una a tres veces (según el nivel de hematocrito de la muestra de sangre) con una solución salina fisiológica. Luego, para la separación, la solución de Pancoll se cubre con la de sangre diluida en un tubo de centrífuga, teniendo cuidado de no mezclar las fases.

Después de un breve paso de centrifugación (por ejemplo, 800 g durante 20 minutos) a temperatura ambiente, los linfocitos, junto con los monocitos y las plaquetas (PBMCs: células mononucleares de sangre periférica), se pueden recolectar de la capa de glóbulos blancos entre la capa de muestra de plasma y el Pancoll. A continuación, las células separadas se lavan dos veces en solución salina fisiológica para purificar los linfocitos mediante la eliminación de plaquetas.

Las células mononucleares de sangre periférica PBMCs: son células sanguíneas con núcleos redondos que comprenden una población celular heterogénea que comprende varias tipos  de linfocitos (células T, células B y células NK), células dendríticas y monocitos (img 2).

Separación en detalle

Durante la centrifugación, las células de la muestra de sangre migran a la capa de Pancoll donde entran en contacto con el polisacárido contenido en Pancoll. Los glóbulos rojos son agregados inmediatamente por esta sustancia a temperatura ambiente. La agregación provoca un aumento de la velocidad de sedimentación de los glóbulos rojos que se agregan junto con los granulocitos como un sedimento en el fondo del vial de centrífuga. Los linfocitos, monocitos y plaquetas (PBMC) no son tan densos y no pueden entrar y pasar a través de la capa de Pancoll. Estas células se concentran como una capa de glóbulos blancos por encima de la capa de Pancoll y, por lo tanto, se pueden recoger fácilmente mediante una pipeta.

En los siguientes pasos de proceso, los linfocitos se lavan para eliminar las plaquetas restantes, el y Pancoll. Como resultado de este proceso se obtiene una suspensión altamente purificada de linfocitos y monocitos viables (PBMC).

Preparación de la muestra

Las muestras de sangre deben procesarse lo antes posible después de su obtención para lograr resultados óptimos y viabilidad celular.

El almacenamiento de las muestras de sangre a temperatura ambiente durante más de 12 horas provoca una disminución en la recogida de linfocitos, cambio en los marcadores de estas células y una disminución a la estimulación mitógena.

Protocolo para el aislamiento de linfocitos

Transfiera Pancoll en condiciones estériles a un tubo de centrífuga estéril. Se pueden utilizar tubos de 50 ml, precargados con 15 ml de Pancoll o tubos de 10 ml precargados con 3 ml de Pancoll. Los tubos de 50 ml se utilizan con muestras de sangre de 15-30 ml y los tubos de 10 ml se utilizan con muestras de sangre de 3-8 ml.

Cubra con cuidado la solución de separación con una capa de la muestra de sangre que previamente se ha diluido de una a tres veces con solución salina fisiológica.

Importante: ¡No mezcle la muestra de sangre con Pancoll!

Centrifugar a 800 g 20 ºC durante 20 minutos. ¡APAGUE EL FRENO!

Después de la centrifugación, retire con cuidado la fase superior (que contiene plasma y plaquetas) con una pipeta, sin mezclar la interfase con los linfocitos.

Con una pipeta nueva, transfiera la banda de linfocitos por encima de la capa de Pancoll a un nuevo vial de centrífuga. Es importante eliminar toda la banda de linfocitos de la interfase con el menor volumen posible.

Si se recoge demasiado Pancoll (fase inferior), puede producirse una contaminación con granulocitos. Si se recoge demasiado sobrenadante (fase superior), se producirá una mayor contaminación con plaquetas.

Añada al menos 3 volúmenes de solución salina fisiológica a los linfocitos, resuspenda los linfocitos con cuidado con una pipeta.

Centrifugar a 300 g  a 20 °C durante 10 minutos.

Desechar el sobrenadante.

Repita el paso de lavado dos veces.

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