El sistema inmunitario innato es un mecanismo celular conservado evolutivamente que, proporciona la primera línea de defensa contra patógenos microbianos tales como virus y bacterias. Hasta hace relativamente poco, la inmunidad innata se consideraba solo como una inmunidad no específica; hoy en día sabemos también que desencadena la activación de vías de señalización que no sólo alertan de la presencia de infección celular, sino también ayudan a que se inicie la respuesta inmune adaptativa a través de la maduración de las células dendríticas (células presentadoras de antígeno).
De entre los muchos complejos y compuestos químicos implicados en la inmunidad innata, destaca la proteína STING.
La proteína STING (proteína estimulador de genes de interferón), también conocida comoTMEM173, MPYS, MITA o ERIS, es una proteína mediadora en la activación de las vías de señalización presente en la membrana plasmática del retículo endoplasmático(y quizás también en la membrana mitocondrial) que facilita la transmisión de señales por su unión a proteínas de la ruta de señalización como TBK1 activándose el IRF3 (factor regulador del interferón) que se transloca al núcleo e induce la producción de interferones de tipo 1 (IFN1) y citocinas de la familia IL-1. También se trata de una proteína importante en el reconocimiento del DNA de doble cadena de origen exógeno presentes en el citosol. La activación de la producción de IFN-1 genera en las células un potente estado antiviral, ya que la presencia de interferones de esta clase, impide la multiplicación viral.
Además del reconocimiento del DNA exógeno descrito anteriormente, STING también parece actuar en el reconocimiento de ácidos nucleicos conocidos como dinucleótidos cíclicos, principalmente el c-di-GMP (monofosfato de diguanilato cíclico) y el c-di-AMP (monofosfato de diadenilato cíclico) que actúan como segundos mensajeros secretados en diferentes procesos metabólicos en bacterias patógenas. Al unirse STING, al dinucleótido cíclico c-di-GMP (presenta una mayor afinidad de unión que el ci-di-AMP) se anula la autoinhibición por conformación estructural producida en la proteína STING. El reconocimiento por parte de STING hacia estos dinucleótidos, se debe fundamentalmente a la presencia de mutaciones en alelos STING de la isoformas tanto humanas como de ratón (hSTING y mSTING respectivamente).
Así mismo, también se observa que la proteína STING es capaz de reconocer e inducir la respuesta inmunitaria (producción de IFN1), a dinucleótido cíclicos no canónicos, fabricados por una enzima presente en la célula: la cGAS (enzima distribuída por todo el citoplasma pero también asociada a membranas plasmáticas de orgánulos o regiones perinucleares), perteneciente a la familia de las nucleotidiltransferasas. Esta enzima, sintetiza un dinucleótido cíclico no canónicos: el cGAMP que desencadene una potente activación de la proteína STING. Dichos resultados determinan que el cGAS permite amplificar de forma simple y vigorosa la respuesta inmune.
A destacar que, en células humanas, cGAS puede activar de manera directa la proteína STING y independiente a la presencia de cGAMP; pero en el caso de células de ratón, es necesaria la producción de cGAMP para la activación de STING. Diferencias alélicas (presencia de alelo H232 y ausencia de alelos R232), se corresponden con respuestas de unión al cGAMP en diferente grado. También no hay que olvidar que la presencia de DNA en el citosol, activa la producción de cGAMP por medio de la enzima cGAS y que la sobreexpresión de cGAS en células carentes endógenamente de STING, provoca la activación del factor de transcripción IRF3 induciéndose la producción de IFNB.
Este reconocimiento de ácidos nucleicos es una estrategia de defensa de las células que opera de forma muy eficiente en diferentes tipos de células, sufriendo diferentes procesos evolutivos en muchos organismos diferentes y permitiendo con ello una modulación de la función de las proteínas de forma diferencial, pero dando lugar a la misma respuesta. De hecho se ha descubierto que, una variante recombinante de STING, la MRP identificada en células HeLa, actúa como un dominante regulador negativo de la expresión de INF1. Otro regulador negativo sería la alteración en la estructura de la proteína Ssr2/TRAP beta, de la familia de las proteínas asociadas a translocadores (TRAP) requeridas en la translocación de proteínas a través de la membrana plasmática del RE después de la traducción proteica.
Para dar apoyo a los investigadores en sus investigaciones sobre la proteína STING y su papel en la ruta de señalización de respuesta del sistema inmunitario innato, IBIAN Technologies propone una gran colección de reactivos y productos desarrollados por la casa InvivoGen.
Los productos son:
Ligandos de la proteína STING
Se proporcionan dinucleótidos cíclicos liofilizados en sales de amonio y agua libre de endotoxinas. Además de los descritos a continuación, también están disponibles los dinucleótidos c-di-GMP y c-di-AMP, así como el c-di-IMP y el c-di-UMP. Todos estos dinucleótidos se comercializan en dos grados:
– Grado estandar: validados para ensayos celulares y con pureza mayor o igual al 95%.
– VacciGrade: con esterilidad garantizada y niveles de endotoxina menores a 1EU/mg, pureza mayor o igual al 95% y validación frente a ensayos celulares.
Ligandos de dinucleótidos cíclicos.
2’3′ cGAMP (eucariotas) → único isómero de cGAMP producido por cGAS en respuesta a DNA citosólico en células eucariotas de mamíferos. Contiene dos enlaces fosfodiéster distintos, uno no canónico en sentido 2′-5′ y otro canónico en sentido 3′-5′. Este ligando se une con alta afinidad a los STING y tiene una potente actividad inductora de IFNB.
3’3′ cGAMP (bacterias) → isómero de la cGAMP producida únicamente en bacterias. Contiene dos enlaces fosfodiéster convencionales en sentido 3′-5′. Induce la ruta de IFN de tipo I y es reconocido por distintas variantes génicas de STING.
2’2′ cGAMP (antinatural o sintético) → dinucleótido cíclico sintético no encontrado en la naturaleza. Contiene dos uniones fosfodiéster en sentido 2′-5′. Comparada con la 2’3′ cGAMP, tiene una baja afinidad de unión a STING pero, en ensayos celulares induce una repuesta IFNB.
Ligandos análogos a xantenonas
DMXAA (específico de raton) → conocida también como Vadimezan o 5,6 dimetilxantenona-4-ácido acético, exhibe actividades inmunológicas moduladoras a través de la inducción de citocinas.
Recientes estudios demostraron que DMXAA contiene regiones diana para la proteína STING, siendo más específicas en el caso de células de ratón. DMXAA no describe estos efectos en la ruta de activación IRF3-NFkb-IFN1 mediada por las proteínas STING, debido a la incapacidad de activar hSTING.
Líneas celulares Reporter STING.
De origen humano o procedentes de ratón, se caracterizan por tener bloqueada la expresión del genes STING. Estas líneas celulares expresan un gen reporter: SEAP o Lucia luciferase bajo el control de un promotor inducible IRF. La inducción del IRF se puede monitorizar midiendo el nivel de SEAP o Lucia luciferase presente en el sobrenadante usando el QUANTI-Blue o el QUANTI-Luc.
Células reporter humanas
HEK-BlueTM ISG-KO-STING → estas células y su línea celular parental HEK-BlueTM ISG (no bloqueada), derivan de la línea celular PEAKrapid, que a su vez, derivan de la línea celular HEK293.
Células reporter de ratón.
B16-BlueTM ISG-KO-STING → estas células y su línea celular parental B16-BlueTM ISG, derivan de la línea celular B16 F1 de melanoma de ratón.
RAW-LuciaTM ISG-KO-STING → son derivadas de la línea celular RAW-LuciaTM ISG que a su vez deriva de la línea celular RAW 246.7 de macrófagos de ratón.
Las células HEK-Blue ISG-KO-STING, HEK-BlueTM ISG, Raw-Lucia ISG-KO-STING y RAW-Lucia ISG se cultivan en medio DMEM, mientras que las células B16-BlueTM ISG-KO-STING y B16-BlueTM ISG se cultivan en RPMI.
Variantes génicas de la proteína STING.
InvivoGen proporcionan la mayoría de las variantes génicas STING descritas, en su vector de expresión pUNO1. Cada plásmido es suministrado liofilizado con cuatro sobres de Fast-media® Blas y un 1ml de Blasticidin a concentración 10mg/ml.
Isoformas STING humanas
Isoforma hSTING-WT
Isoforma hSTING-H232 (R232H)
Isoforma hSTING-A230 (G230A)
Isoforma hSTING-HAQ (R17H-G230A-R239Q)
Isoforma hSTING-A162 (S162A)
Isoforma hSTING-N200 (I200N)
Isoforma hSTING-MRP
Isoformas STING de ratón.
Isoforma mSTING-WT.
Isoforma mSTING-Gt (I199N).