Amplicon deep-sequencing usado en next generation sequencing (NGS) se ha convertido en una herramienta de estudio de la diversidad de comunidades microbiológicas. Secuenciando las partes del DNA ribosomal (16S rDNA or ITS) de muestras ambientales, NGS puede generar grandes cantidades de datos que permitirán un rápido y profundo análisis de las comunidades microbianas. Sin embargo, el proceso y evaluación de las secuencias de NGS es un gran reto debido a la gran cantidad de datos generados.
Importancia de seleccionar el barcoding locus apropiado
Los estudios de metagenómica generalmente son realizados por análisis de amplicon de rDNA 16s en procariotas o de regiones internas espaciadoras transcritas (ITS) en hongos (figura 1). Los dos loci forman un mosaico de regiones muy conservadas e hipervariables.
Todavía no es posible secuenciar amplicones que se expandan la longitud completa del rDNA 16S (~1.3 kb) o las regiones ITS porque la longitud de lectura de NGS es limitada. Las partes del 16S rDNA o ITS que mejor se amplifican todavía está bajo debate, y varía dependiendo del objetivo del estudio, el diseño experimental y el tipo de muestra. En general, si tu objetivo es obtener una escala taxonómica con resolución, deberías cubrir el máximo número posible de regiones variables en tu PCR. El reto de los proyectos, es encontrar el equilibrio entre la resolución taxonómica y el sesgo de la amplificación por PCR que resulta en una sub-representación o perdida de entidades taxonómicas. Normalmente, solo un estudio piloto ayuda a encontrar el mejor primer para un objetivo concreto.
Competencias y servicios
Ibiantechnologies ( distribuidor de productos,reactivos y materiales de laboratorio destinado a la investigación y al diagnóstico) en colaboración con Microsynth es capaz de ofrecer un completo servicio que cubre el proceso entero desde el diseño del plan experimental, aislamiento de DNA, amplificación por PCR, secuenciación y análisis bioinformático de los datos generados (Figura 2).
- Aislamiento de DNA: el cliente proporciona el DNA aislado o Microsynth realiza esta tarea (más de 13 años de experiencia)
- Amplificación por PCR: Sigue un protocolo de dos pasos haciendo uso de polimerasas de alta fidelidad. Estos dos pasos se aplican para aumentar la reproducibilidad y para mejorar la producción de librerías de amplicones de alta calidad. Los productos de PCR están purificados, cuantificados con espectroscopia de fluorescencia usando Picogreen y agrupado en grupos equimolares.
- NGS sequencing: Para la secuenciación se usa Illumina MiSeq que permite un alto rendimiento a un bajo coste con la ventaja de largas lecturas (hasta 570 bp).
- Análisis bioinformático: dependiendo de los requerimientos del cliente Microsynth ofrece un análisis básico de bioinformática o paquetes más complejos. Ambos están basados en Qiime software. El paquete básico proporciona perfiles taxonómicos y medidas de α-diversidad (diversidad de los organismos en una muestra). Los paquetes más avanzados están basados en los básicos pero añaden medidas de β-diversidad (diversidad de los organismos en varias muestras). El análisis comparativo de los paquetes avanzados, basado en parámetros experimentales (diferentes condiciones de pH,temperatura etc) permite testar las hipótesis experimentales.
Perfil microbiano con los paquetes básicos de bioinformática
Procesamiento de datos:
Enriquecimiento de datos: el software Qiime en combinación con una base de datos se usa para definir unidades taxonómicas operacionales (OTUs) y para asignar a cada OTU a una entidad taxonómica en los diferentes niveles taxonómicos (Figura 3)
α-Diversidad: Se calculan las diversidades Chao1. También se realiza un análisis de rarefacción para ver si el muestreo ha sido exhaustivo (Figura 4).
Perfil microbiano con paquetes avanzados de bioinformático
El análisis bioinformático avanzado incluye los resultados del análisis básico. Además, las estructuras de las comunidades microbianas son comparadas con los parámetros ambientales proporcionamos por el cliente en un contexto filogenético.
La base de datos OTU obtenida con los paquetes básico sirve como una fuente para análisis adicionales.
Enriquecimiento de datos: en un primer paso un árbol filogenético es calculado para todos los OTUs en la base de datos (UniFrac). El árbol filogenético es básico para el análisis comparativo y el cálculo de la β-diversidad.
La β-diversidad es un overview cualitativo de la diversidad entre las muestras obtenido a partir de una media del análisis (PCoA Figura 5A )
