Mejora de protocolos y rendimiento
Se han ideado diferentes métodos de amplificación de ácidos nucleicos con la intención, en muchos casos, de mejorar los protocolos de actuación así como el rendimiento final de la técnica. Uno de estos nuevos métodos es el conocido como Strand Displacement Amplification (SDA) o también denominado PCDR o reacción en cadena con desplazamiento de la polimerasa, una modificación de la PCR convencional, que contiene esas mejoras mencionadas.
Esta amplificación con desplazamiento de hebra es una técnica novedosa, que trata de reducir el protocolo de la técnica, limitándolo a un único tubo de ensayo, para así evitar posibles contaminaciones que alteren el resultado, y a su vez, aumentando la velocidad final de la reacción . Para ello, se usan las plataformas convencionales de las PCR cuantitativas y un mayor número y concentración de primers, incrementando la eficiencia y sensibilidad de la técnica para la amplificación de ácidos nucleicos.
Esta PCDR es una técnica isotérmica ( no requiere de la presencia de ciclos de temperaturas para la desnaturalización de las hebras de DNA, ya que, debido a la presencia de enzimas de restricción, este proceso se realiza de forma enzimática) basada en la capacidad de una DNA polimerasa modificada, para desplazar una hebra monocatenaria resultante de un corte en una región específica, y a partir de esta hebra desplazada, iniciar la replicación o amplificación de ese DNA diana. Con este procedimiento, las hebras desplazadas sirven como molde para los nuevos ciclos de amplificación, generando por un lado que, los productos de amplificación se multipliquen por más de 2 veces al final de cada ciclo de amplificación y por otro, se observe un incremento en la velocidad de reacción, sensibilidad y especificidad de la técnica respecto a la PCR convencional.
La técnica de la SDA o PCDR se puede resumir en el siguiente orden:
Primero se adicionan múltiples primers, que cuentan por un lado, con una longitud mayor que los de una PCR convencional (con motivo de que las secuencias sean amplificadas aunque presenten variaciones); y por otro, con dos secuencias nucleotídicas específicas: una complementaria a la región diana de 15 a 20 pares de bases, y otra, complementaria a la secuencia de restricción de las endonucleasas.
A continuación, se produce la incubación e hibridación (annealing) de los primers con la región diana del DNA que se quiere amplificar. Se suele usar en este paso, una sonda doblemente marcada, con un quencher en el extremo 3′ y un fluoróforo en el extremo 5′. Cuando en la mezcla no está presente la región diana que se pretenden amplificar, ambos extremos de la sonda, se unen entre sí formando un bucle aleatorio generando el apagado del fluoróforo; si está presente en la reacción la región diana de interés, se separan los extremos de la sonda, y se produce la fluorescencia, gracias a la cual, se detecta y cuantifica más rápida y eficazmente los productos de la amplificación.
Gracias a estos dos pasos iniciales, se garantiza la especificidad de la técnica PCDR, evitando así resultados falsos o alterados debido a las posibles mutaciones en regiones complementarias de los primers o en zonas de hibridación de sondas.
El siguiente paso consiste en la adicción de la DNA polimerasa, presentando en este caso, actividad de desplazamiento de hebra pero no la actividad exonucleasa 5′ → 3′. Como en la PCR convencional, también es necesario añadir desoxi-nucleótidos en este paso, que serán usado en el inicio de la elongación de los primers. Tras esta adicción, tiene lugar la primera etapa de reacción de amplificación de ácidos nucleicos: la elongación de los primers por parte de la DNA polimerasa. Este paso comienza con la síntesis de una hebra a partir del sentido 5′ de las secuencias adyacentes de la región diana, originándose así un nick o mella en la hebra. La nueva hebra sintetizada, es cortada por una endonucleasa de restricción, que realiza un corte específico en la secuencia originado un extremo 3′, que servirá como molde para la síntesis de una nueva hebra de DNA.
Como resultado del paso anterior, se inicia una nueva síntesis de hebra a partir de del extremo 3′ generado por la endonucleasa de restricción y, a diferencia de la PCR convencional gracias a las características de la SD polimerasa utilizada, se produce un desplazamiento en la hebra de nueva síntesis. La deficiencia de la actividad exonucleasa en sentido 5′ → 3 SD polimerasa, impide en este punto, que la hebra de nueva síntesis desplazada sea degradada y que, a su vez, la extensión de la hebra de nueva síntesis, sea bloqueada. Gracias a esta última característica, se impide una disminución en la eficacia y sensibilidad de la técnica.
Como último paso, tiene lugar un corte en la hebra desplazada que permite que sea de nuevo usada como molde de nuevo, repitiendo de nuevo los pasos descritos anteriormente, observándose desplazamientos de las hebras de la zonas más internas a la vez que se van amplificando las hebras de las zonas más externas. Como consecuencia final de esta repetición, se consigue aumentar al doble el número de secuencias diana a amplificar y con ello el número de productos de amplificación (pueden llegar a valores de 109 copias por cada reacción en cadena con desplazamiento).
Debido a sus características técnicas, se considera a la PCDR, técnica clave para amplificar secuencias específicas de DNA usadas en estudios de biología molecular. Su uso se considera óptimo para la realización de ensayos donde se utilicen secuencias dianas del DNA a estudiar en baja concentración y/o con regiones con dificultades a la hora de amplificarlas, por ejemplo, diagnósticos de carga viral y análisis serológicos, así como, para la detección de variables genéticas de virus con alta tasa de mutación, mejorando los resultados de los tradicionales estudios basados en cultivos de virus en líneas celulares.
Como se puede comprobar en la descrito más arriba, para que esta técnica tenga lugar es necesaria la presencia de una polimerasa con actividad de desplazamiento de hebra y deficiente en la actividad exonucleasa en sentido 5′ → 3′. En este punto, encontramos en la bibliografía, que existe un grupo reducido de enzimas de origen natural, conocidas como polimerasas de las familias A, B y RT polimeresas, que se caracterizan, entre otras cosas, por tener actividad de desplazamiento de hebra. De entre las más conocidas y/o usadas con mayor frecuencia en los ensayos y trabajos prácticos, encontramos la φ29 DNA polimerasas y la Bst DNA polimerasas. Sin embargo, para el caso de la técnica PCDR,en ambos casos, se observan ciertos aspectos que no las hacen aptas para ser usadas en esta amplificación con desplazamiento de hebra.
En el caso de la φ29 DNA polimerasa, aunque presente una fuerte actividad de desplazamiento de hebra, su baja temperatura de optimización (sobre 37ºC) no la hace considerarse enzima apta para la amplificación de secuencias específicas. Por otro lado, en el caso de la Bst DNA polimerasa (que en principio, se considera una mejor opción que la φ29 DNA polimerasa debido a su temperatura óptima de 63ºC, lo que la hace apta para la amplificación de secuencias específicas) tampoco se la considera una buena opción para este tipo de amplificación, por dos razones: una, se inactiva a temperaturas superiores a 68ºC y dos, el mecanismo de desplazamiento de hebra que utiliza es muy confuso y de difícil reproducibilidad.
Estos motivos fueron los que desencadenaron los estudios encaminados a encontrar una DNA polimerasa diseñada en laboratorio, que presentara como principal característica una fuerte actividad de desplazamiento de hebra con la que se realizaran de forma exitosa amplificaciones de regiones “difíciles” del DNA. A lo largo del tiempo se sucedieron varios intentos por parte de varios laboratorios sin éxito, hasta que el laboratorio Bioron GmbH, consigue diseñar la llamada SD Polimerasa, una innovadora polimerasa que presenta una fuerte actividad de desplazamiento de hebra y resulta óptima para diversos métodos de amplificación de DNA, isotérmicos y convencionales.
La SD Polimerasa (Bioron GmbH) es una variante artificial de la Taq polimerasa utilizada en la PCR convencional, que posee una fuerte actividad de desplazamiento de hebra obtenida por la modificación de las secuencias de aminoácidos pertenecientes a la conformación estructural de la Taq polimerasa. Con esta variación, se originan cuatro sitios en su estructura tridimensional que participan y son esenciales en la actividad de desplazamiento de hebra.
Uno de los sitio originados en la conformación proteica, se encarga de desestabilizar la complementariedad entre las pares de bases dispuestas en la región de bifurcación de las hebras, actuando también en el desplazamiento de la hebra de nueva síntesis. Otra de las regiones originadas por la modificación, permite impedir la re-asociación del dúplex de DNA matriz al unirse a la hebra matriz fuertemente y las otros dos sitios observados, son los encargados de crear puentes de hierro que estabilizan químicamente, la conformación estructural de la proteína.
Esta SD polimerasa, además de estas modificaciones estructurales que favorecen la presencia de la actividad de desplazamiento de hebra, también se caracterizan por presentar una mejora en la termo-estabilidad, siendo estable por encima de los 93ºC lo que la hace adecuada no solo para técnicas isotermas con o sin pre-calentamiento previo (tanto φ29 como Bst DNA polimerasa se inactivan por encima de los 70ºC, no siendo aptas para PCR convencionales, reduciendo así su eficacia) sino también para las PCR convencionales, sobre todo si se usan bajas concentraciones de DNA diana, patrones de más de 20 kilo bases (kb) de longitud o con presencia en las regiones de DNA diana, de secuencias nucleotídicas con riqueza de guanina – citosina (GC) de más del 70%.
Datos preliminares determinaron, que el uso de la SD polimerasa en la PCR convencional genera una mayor eficiencia y sensibilidad que la observada cuando se usa la Taq polimerasa, incluso en técnicas de Long PCR (cuando se emplean como regiones diana, secuencias nucleotídicas de longitud superior a 5kb) sin requerir adicción extra de enzimas para que la técnica se reproduzca fielmente.
Por si se quiere saber más acerca de esta novedosa enzima, aquí se describen las principales características y recomendaciones de uso de la SD polimerasa y SD polimerasa Hotstart, comercializada por IBIAN Technologies.
- Actividad: Polimerasa 5′ → 3′ ; Desplazamiento de hebra 5′ → 3′. No presente actividad exonucleasa.
- Temperatura óptima: 62ºC – 70ºC. Termo-estabilidad a más de 93ºC. Temperatura recomendada para la desnaturalización inicial para PCR y ALMP: 92ºC.
- pH óptimo: 8.6 – 8.9.
- Concentración: 10 unidades/microlitro. Unidad: cantidad de enzima requerida para incorporar 10 nmoles de dNTPs dentro de una fracción ácido-insoluble de DNA durante 30 minutos a 68ºC.
- Buffers incluidos en el kit:
– Buffer de reacción (10X) “complete”.
– MgCl2 100 mM. Concentración final recomendada 3 – 3,5mM
– Buffer de reacción KCl “complete” (10x) (incluido únicamente en la SD polimerasa)
– Ficha técnica del producto.
- Control de calidad: testes de calidad frente a varios patrones (humano, bovino y fago lambda), testes para determinar la ausencia de actividad endonucleasa y nickase; test de contaminación exo-endonucleasa; “no primer” testes, “no template” testes.
- Aplicaciones: LAMP (concentración recomendada 15 – 50 unidades/50 microlitros); PCR (concentración recomendada 1.5 – 15 unidades/50 microlitros), PCDR (concentración recomendada 1.5 – 15 unidades/50 microlitros).
- Condiciones de almacenamiento: guardar a – 20ºC.
- Recomendaciones de uso
- Programar el ciclo de amplificaciones según indicado en el manual.
- El tiempo de elongación recomendado para patrones de 1kb de longitud es de 15 -40 segundos.
- Para un máximo rendimiento y especificidad, las temperaturas de hibridación y los tiempos de los ciclos de amplificaciones deben ser optimizados para cada nuevo par de primers o nuevo patrón a amplificar.
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Bibliografía
HARRIS, C.L.; SANCHEZ-VARGAS, I.J.; OLSON, K.E.; ALPHEY, L.; FU, G. “Polymerase chain displacement reaction” BioTechniques, Vol. 54, No. 2, February 2013, pp. 93–97
SPARGO, C.A.; DEAN, C.H.; NYCZ, C.M.; WALKER, G.T.; “SDA Target Amplification” Nonradioactive Analysis of Biomolecules Springer Lab Manuals 2000, pp 356-366
BIORONGmbH “Novel Thermostable DNA polymerase with a strong Strand Displacement Activity” Junio 2013.