Se entiende por cultivo celular, el conjunto de técnicas que permiten el mantenimiento de células in vitro, preservando al máximo sus propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas. Bajo unas condiciones adecuadas (medios y superficies de cultivo, presencia de antibióticos, asepsia ambiental, instrumental adecuado, etc) se consiguen mantener clones de un solo tipo de células de origen animal y/o vegetal bien definidos a partir de cada cultivo celular. Debido a que se facilita su manipulación, se puede alcanzar una mayor viabilidad en las células lo que, hace que los cultivos celulares sean óptimos para trabajos de investigación básica, estudios de ingeniería genética y/o producción de compuestos biológicos como, por ejemplo, vacunas virales.
El primer investigador en darse cuenta de la gran potencialidad del cultivo celular como técnica de mantenimiento de células in vitro, fue Wilhem Roux, embriólogo alemán quién, en 1885, cultivó células de embrión de pollo en solución salina durante días. Con este experimento, demostró que las células embrionarias podían sobrevivir sin requerir la presencia de un organismo que las mantuviera vivas en su interior. Esto llevó a que, en el siglo XX, se desarrollara esta técnica con el fin de dar una explicación a los procesos fisiológicos, destacando en este aspecto, los trabajos del zoólogo americano Ross Granville Harrison sobre cultivos de médula espinal embrionaria de anfibios para explicar la formación del axón de las neuronas.
A pesar de estos avances iniciales, existía una gran limitación inicial: los cultivos celulares hasta entonces utilizados, no disponían de medios nutritivos adecuados para la propagación de las células en dicho cultivo. Gracias a la labor realizada por M. Burrows, esta limitación dejó de ser un problema. Burrows descubrió que el plasma era un nutriente esencial en los medios de cultivo, siendo además éstos, óptimos para la propagación de células de diversos tejidos celulares en condiciones in vitro. Otros investigadores que realizaron trabajos de cara a la mejora de la técnica de cultivo celular, serían Prous y Jones, primeros en utilizar la tripsina para disgregar las células y permitir así constituir el primer cultivo celular propiamente dicho. Sin embargo, aún no se lograban eliminar otras limitaciones como la poca viabilidad y las elevadas contaminaciones que se producían en los medios. Pronto serían solventadas, gracias al trabajo realizado por Alexis Carrel que junto con M. Burrows, añadiría a los medios de cultivo factores de crecimiento mejorando su función nutricional siendo clave también, el desarrollo del conocido frasco de Carrel, esencial para evitar las contaminaciones microbianas que se producían habitualmente y con ello, garantizar el éxito de la propagación de las células en cultivo in vitro.
Otros avances reseñables de la técnica de cultivo celular fueron, uno en 1949 cuando Alan Parks fija las condiciones de congelación de los cultivos celulares en nitrógeno líquido para evitar la pérdida de viabilidad celular y, otro en 1952, cuando Scherer, Syrventon y Gey consiguen desarrollar la primera línea celular, la conocida como células HeLa que, aunque inicialmente se utilizó para el estudio de virus de la poliomelitis, hoy en día es una de las líneas celulares con mayor aplicación biomédica. También es necesario recordar los trabajos de Rita Levi-Montalcini sobre la estimulación propiciada por factores de crecimiento nervioso, de los investigadores L. Hayflick y P. S. Mooheart sobre las líneas celulares finitas de fibroblastos, o las líneas celulares productoras de anticuerpos monoclonales descritas por George Köhler y César Milstein. En la actualidad, uno de los avances más destacables de la técnicas de cultivo celular se consiguió cuando se reprogramaron células adultas en células pluripotenciales inducidas alcanzado por Takahashi y Yamanaka en 2006.
Todos estos avances hacen referencia a la técnica de cultivo celular en diferentes vertientes pero, no debemos olvidarnos de los avances producidos en cuanto a la mejora de los medios de cultivo, principales factores implicados en el mayor o menor éxito del cultivo de células in vitro. Cada tipo de cultivo celular requiere un medio de cultivo específico, sin que exista una fórmula universal y precisa para ello. Los primeros medios de cultivo consistían en suero sanguíneo, plasma y linfa. A través de los trabajos de Burrows, Carrel y Levi-Montalcini se establecieron los factores de crecimiento como requerimientos nutricionales fundamentales en los medios de cultivo, apareciendo así los primeros medios de cultivo sintéticos. En 1950, destacó el diseñado por Morgan conocido como “medio 199” y que contenía hasta un total de 61 nutrientes sintéticos y entre un 5-10% de suero fetal bovino.
Sin embargo, la gran revolución en cuanto a avance en medios de cultivo se refiere, vino de la mano de Eagle y sus investigaciones sobre los requerimientos nutricionales presentes en el cultivo de células HeLa y células L (de ratón) en cultivo. A través de ellos, consiguió definir 28 sustancias esenciales para dicho desarrollo y mantenimiento in vitro, siendo las más importantes la glucosa, los aminoácidos precursores de proteínas, las vitaminas, los sales minerales y las soluciones corporales complejas (suero) en mínimas cantidades (aproximadante 1%). A partir de este hallazgo, Eagle consiguió desarrollar dos medios de cultivo ampliamente conocidos y usados habitualmente:
a) medio basal de Eagle (MBE), medio semi-sintético que contiene además de glucosa, 13 aminoácidos precursores de proteínas, 8 vitaminas y 6 sales minerales que actuarán como cofactores metabólicos, buffers para el mantenimiento del pH y del balance eléctrico y suero fetal bovino (BSF) como principal portador de factores de crecimiento y fibronectina, esenciales para la adhesión, división y visibilidad de las células.
b) medio Eagle mínimo esencial (EMEM), medio similar al MBE pero con una mayor concentración de de aminoácidos precursores de proteínas y vitaminas. Con este medio se consigue un mayor mantenimiento de las células in vitro, sin requerir de renovaciones o cambios del medio de cultivo durante un período de tiempo.
Además de estos medios básicos, encontramos los medios desarrollados por Ham en 1965, responsable de introducir los medios de cultivo definidos libres de suero capaces de mantener células de mamífero en cultivo in vitro indefinidamente y, las soluciones balanceadas (SSB) de J.H. Hanks y W.R Earle (conocidos como medios de mantenimiento) que son utilizadas como diluyentes de los nutrientes del medio de cultivo y permiten mantener el pH y presión osmótica del medio en unos valores concretos, así como, a las células en cultivo durante períodos de tiempo cortos. Debemos diferenciar entre, la SSB de Hanks que se utiliza para incubar cultivos en sistemas cerrados y la SSB de Earle que se utiliza para incubar cultivos en atmósferas a 5% de CO2. Estas soluciones además de iones (Na, Ca, Mg, Cl, P, K), azúcares, aminoácidos, vitaminas y minerales contiene elementos adicionales como hierro, zinc y selenio así como antibióticos y antimicóticos.
En resumen, un buen medio de cultivo será áquel que reúna las siguientes cualidades: especificidad respecto a la célula a cultivar, carácter nutritivo, con valores de pH adecuado, capacidad de buffer, isotónico y por supuesto, estéril. Hoy en día, numerosas compañías comerciales producen diferentes medios de cultivo en función de su especificidad, pero este artículo quiere centrarse en los medios de cultivo comercializados por la compañía IBIAN Technologies (distribuidor de productos, materiales y reactivos de laboratorio destinado a la investigación y al diagnóstico) y producido por la casa Pan – Biotech GmbH. Estos se clasifican según su especificidad en:
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Medios completos.
1.1 PANTUM 386
Específico para el crecimiento de células epiteliales. Se trata de un medio DMEM con formulación modificada. Contiene: proteínas plasmáticas, lípidos, colesterol, albúmina, factores de crecimiento, componentes procedentes de extractos de soja, proteína transportadora de hierro. No requiere la adicción de suero o factores de crecimiento lo que, reduce la probabilidad de contaminación del medio y permite una tasa de crecimiento estable bajo unas condiciones definidas.
Recomendaciones de uso: se recomienda para cultivos celulares con densidad celular entre 2.000 y 10.000 células/m2. Se puede utilizar como medio de cultivo alternativo al medio convencional. Para células sensibles, es necesario una adaptación gradual. Si se usa tripsina para favorecer la dispersión de las células, debe asegurarse que la enzima se elimine por completo para evitar interacciones con los componente del medio PANTUM 386.
Almacenamiento: -20ºC en ausencia de luz (Entre 2-8ºC no más de 3 meses). Caducidad: 2 años a partir de la fecha de producción.
1.2 PANTUM L24
Específico para el crecimiento de linfocitos. Contiene la fitohemaglutinina PHA, principal activador del ciclo celular en linfocitos adultos. Se trata de un medio obtenido por formulación modificada del medio RPMI 1640 conteniendo además, una mezcla balanceada y reproducible de factores de crecimiento, proteínas plasmáticas, lípidos, aminoácidos, componentes de extractos de soja, colesterol, albúmina, proteína transportadora de hierro. Con esta composición, se favorece la optimización del cultivo celular, sin requerir una adición extra de suero o factores de crecimiento y con ello, una posible contaminación.
Aunque se uso primordial se destina a cultivos primarios, PANTUM L24 también es apto para el cultivo de líneas celulares.
Almacenamiento: -20ºC en ausencia de luz (Entre 2-8ºC no más de 3 meses). Caducidad: 2 años a partir de la fecha de producción.
1.3 PANTUM T64
Específico para el crecimiento de células tumorales. Se trata de una formulación modificada del medio RPMI 1640 conteniendo además factores de crecimiento, proteínas plasmáticas, lípidos, aminoácidos, componentes de extractos de soja, colesterol, albúmina, proteína transportadora de hierro. Con esta composición, se favorece una mayor optimización del cultivo celular, sin requerir de una adición extra de suero o factores de crecimiento y con ello, una posible contaminación en el medio de cultivo.
Recomendaciones de uso: se recomienda para cultivos celulares con densidades de propagación celular entre 2.000 y 10.000 células/m2. Se puede utilizar como medio de cultivo alternativo al convencional en la mayoría de células. Para células sensibles, es necesario una adaptación gradual.
Almacenamiento: -20ºC en ausencia de luz (Entre 2-8ºC no más de 3 meses). Caducidad: 2 años a partir de la fecha de producción.
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Formulaciones especiales.
2.1 ENDOPAN 3 READY-TO-USE
Formulación específica para células del endotelio microvascular de origen humano. Su uso se destina exclusivamente a la investigación, no siendo apto para diagnósticos o tratamientos. Consta de:
Endopan 3 listo para usar es un medio de crecimiento de células endoteliales especialmente desarrollado para el cultivo in vitro de células endoteliales primarias humanas. Contiene todos los componentes necesarios para un crecimiento óptimo y está diseñado para usarse en una incubadora a 37 ° C con una atmósfera de CO2 al 5%.
2.1.2 ENDOPAN 3 KIT
Consiste en un kit que contienen todos los componentes nutricionales necesarios para la elaboración de medios de cultivo para diferentes aplicaciones y/o técnicas. Cada presentación contiene: suero fetal bovino, factores de crecimiento epidérmicos, de fibroblasto, de endotelio vascular e insulinémico, vitamina C, hidrocortisona y gentamicina/anfotericina.
Recomendaciones de uso: Esta formulación no debe utilizarse para cultivos de células endoteliales de uso habitual y prolongado en el tiempo. Deben asegurarse las condiciones de esterilidad a la hora de añadir los componentes para la elaboración de los medios de cultivo. Debe realizarse la mezcla homogénea de todos los componentes. No debe congelarse.
Almacenamiento: -20ºC los componentes del kit y entre 2 – 8ºC el medio de cultivo.
2.1.3 ENDOPAN MV medio
Está diseñado para ser empleado en una incubadora a 37ºC y una atmósfera con 5% de CO2, ambas condiciones son necesarias para el óptimo crecimiento de las células de endotelio vascular en cultivo.
Recomendaciones de uso: Evitar repetidas incubaciones del medio de cultivo. En el primer cultivo cambiar el medio tras 24 horas, para eliminar células no adheridas tras la congelación inicial. Para facilitar la propagación y mantenimiento de las células in vitro, se debe cambiar el medio cada 2-3 días, en el caso de proliferación muy extensas, realizar el cambio de medio más frecuentemente o añadir más medio de cultivo. No debe congelarse.
Almacenamiento: 2-8ºC en ausencia de luz.
ENDOPAN MV:
a) Contiene baja concentración de suero fetal bovino (sólo 6%) por lo que debe evitarse exponer el medio de cultivo a la acción de la tripsina durante un período de tiempo largo.
b) ENDOPAN MV se ha testado para garantizar la fiabilidad y optimización de la propagación celular y la ausencia de contaminación microbiana (bacterias, levaduras, hongos y micoplasmas).
2.2 AMNIOPAN S2.
Medio completo específico para el cultivo y diagnóstico in vitro, optimizado para establecer cultivos primarios de células humanas del liquido amniótico y biopsia de vellosidades coriales, con aplicación directa para análisis y estudios citogenéticos, cariotipaje o hibridación con fluoresencia in-situ (FISH). Se trata de una formulación basada en el medio Alpha – MEM. En su composición nutricional encontramos: suero fetal bovino, factores de crecimiento, L-glutamina, hormonas y antibióticos.
Además de la aplicación mencionada , AMNIOPAN S2 también es apto para el cultivo de células del saco amniótico destinadas al posterior estudio de desórdenes cromosómicos. (ver Citogenética)
Recomendaciones de uso: Deben evitarse las exposiciones repetidas al calor, al frío y a la luz.. No debe pasar mucho tiempo en su uso una vez descongelado y abierto el envase.
Almacenamiento: 20ºC
Este medio de cultivo se comercializa bajo un control de calidad conforme a los requerimientos del sistema ISO 9001/EN e ISO 13495.
