Sondas Double-Quenched para Q-PCR
IBIAN TECHNOLOGIES (distribuidor de productos, reactivos y materiales de laboratorio destinados a la investigación y el diagnóstico en las áreas de Biología Molecular, Celular y Microbiología) en colaboración con Microsynth le permite acceder a sondas marcadas muy atractivas entre las que cabe destacar las “double-quenched”.
La PCR cuantitativa (qPCR o real time PCR) es una importante herramienta para detectar, específicamente, secuencias de DNA en una muestra o incluso entre mezcla de muestras. Debido a la simplificad experimental del set-up y el corto tiempo necesario, el uso de hibridación mediante sondas doblemente marcadas se ha convertido en el método más favorable desde diferentes enfoques.
Para obtener resultados fiables en experimentos de qPCR, el ruido de fondo debe ser reducido a niveles mínimos. Esto se consigue maximizando la pérdida de fluorescencia de la sonda inicial o transfiriendo completamente la luz emitida de la fluorescencia 5 ‘donante al receptor 3’.
Como el efecto FRET depende de la distancia del donador y el fluoróforo receptor, las sondas cortas, donde el donador está cerca del aceptor sería lo deseable. Normalmente sondas con una longitud de 15 nucleótidos muestran una alta eficiencia. Cuando las sondas son de 25 nucleótidos o más largas, la transferencia de energía se ve reducida considerablemente y el background de la fluorescencia aumenta.
Diseño inteligente de sondas
Una forma elegante de aumentar el quenching de las sondas de qPCR es colocar una “quenched-probe” interna adicional a una distancia próxima del fluoróforo donador ( Figure 1). Estas sondas se denominan “double-quenched probes” (sondas de doble apagado). Microsynth ha evaluado un gran número de sondas, en las que la sonda interna difería en la posición relativa al marcaje 5’FAM. Entre todas las sondas probadas las que tenían iQ500 en el interior mostraron el background de fluorescencia más bajo. El comportamiento óptimo de las sondas fue obtenido cuando los quenchers fueron posicionados a 9 nucleótidos del 5’FAM. Sin embargo, variaciones en la posición eran bien toleradas.
Sondas standard vs Sondas double quenched
El efecto de las sondas double quenched y de las sondas standard se puede comparar observando los datos y la curva normalizada que aparece a continuación . Las sondas double quenched muestran una reducción del background de la fluorescencia y aumento de la señal en el endpoint. Como consecuencia, la exactitud y robusted de los experimentos de qPCR ha aumentado.
El efecto positivo de las sondas double quenched es incuestionable desde el punto de vista de la qPCR. La estructura interna del apagador esta basada en el sistema aromático planar que potencia la intercalación con el DNA. Además, permiten temperaturas de hibridación mayores.
iQ500 debería ser usado solamente en combinación con FAM/BHQ1. En algunos casos podría usarte también en combinación con JOE/BHQ1 o HEX/BHQ1 pero sin embargo el efecto es menos distintivo que con FAM.
