Un enfoque integral con Twin-Strep-tag
La identificación y producción de anticuerpos monoclonales resulta crucial tanto para indagar en las respuestas inmunitarias como para el desarrollo de terapias innovadoras. Asimismo, estos anticuerpos tienen la capacidad de ser empleados en la detección directa e indirecta de antígenos en una amplia gama de ensayos. Pueden servir, por ejemplo, como molécula de captura inmovilizada en microplacas o como ligandos para la purificación de proteínas, lo que los convierte en una herramienta versátil en biotecnología.
Diversos métodos han sido desarrollados para descubrir anticuerpos monoclonales, entre los que se incluyen la tecnología de hibridoma, la presentación en fagos y la clasificación de células B individuales.
El objetivo común de estos métodos es la identificación de anticuerpos de alta afinidad capaces de reconocer un antígeno específico. En este sentido, el antígeno se posiciona como un componente central en el desarrollo de anticuerpos.
Incorporar la etiqueta Twin-Strep-tag a un antígeno facilita su uso en múltiples pasos del desarrollo, gracias a su alta afinidad y versatilidad. Además, la tecnología Strep-tag puede integrar múltiples pasos en una sola plataforma, lo que resulta en un desarrollo de anticuerpos más eficiente en términos de tiempo y costo
Twin-Strep-tag resulta útil para:
- Purificación y análisis de antígenos (proteínas).
- Inmunización.
- Tinción y aislamiento de células B específicas de antígeno mediante FACS.
- ELISA y transferencia Western.
- Aplicaciones de biosensores.
- Biopanning.
Veamos en detalla las diferentes aplicaciones:
Expresión y purificación de antígenos para el desarrollo de anticuerpos.
La producción de un antígeno es un paso crucial en el desarrollo de anticuerpos, ya que es necesario para diversas etapas del procedimiento, como la inmunización y la caracterización de los anticuerpos.
Las ventajas de emplear el sistema Strep-tag® para la purificación de antígenos son varias:
- Proporciona preparaciones de antígenos de alta pureza, ideales para la inmunización y otros procesos posteriores.
- El procedimiento de aislamiento es simple y no requiere pasos tediosos de optimización.
- Los antígenos son reutilizables incluso después de procedimientos de limpieza in situ (CIP).
- Además de los vectores necesarios y un sistema de expresión, se encuentran disponibles diversos formatos de purificación que permiten ajustar la escala individualmente o automatizar el proceso de producción de proteínas. La fusión de un antígeno con Twin-Strep-tag® no solo garantiza la excelente pureza del objetivo, sino que también proporciona opciones de aplicación versátiles para diversos procesos posteriores.
La alta afinidad picomolar del Strep-tag® con su ligando permite su utilización en biosensores, como la resonancia de plasmón de superficie (SPR) o la interferometría de biocapas (BLI, del inglés Biolayer Interferometry). Esto elimina la necesidad de cambiar entre diferentes etiquetas según la aplicación, lo que agiliza y optimiza todo el procedimiento.
Análisis de antígenos para el desarrollo de anticuerpos.
Una vez que el antígeno ha sido purificado a partir de fuentes como lisados celulares o medio de cultivo celular, es crucial determinar su pureza, integridad y concentración. Para ello, se pueden emplear diversas técnicas. La tinción de Coomassie o plata, así como la cromatografía analítica de exclusión por tamaño, son opciones útiles para identificar la presencia de proteínas inespecíficas en una muestra.
Una forma efectiva de verificar la correcta producción del antígeno es mediante la detección de su Twin-Strep-tag® en una transferencia Western. Esta técnica permite identificar si la proteína se ha producido exitosamente en el tamaño esperado y si no se han formado productos de agregación o degradación.
Inmunización para el desarrollo de anticuerpos.
La aplicación de la tecnología Strep-tag® en la purificación de proteínas resulta en la obtención de un antígeno de alta pureza, idóneo para ser utilizado en la inmunización de una especie huésped. Como pasos de procesamiento opcionales adicionales, se puede llevar a cabo la eliminación de biotina, el eluyente, de la fracción de elución mediante diálisis o exclusión por tamaño, así como la escisión TEV de Twin-Strep-tag®.
Sin embargo, debido al tamaño reducido de la etiqueta, compuesta por solo 28 aminoácidos, se espera que la inmunogenicidad sea baja.
Para determinar la concentración del antígeno obtenido, se puede recurrir al ensayo ELISA, un método adecuado y ampliamente utilizado en este contexto. Este ensayo proporciona una medida precisa de la cantidad de antígeno presente en la muestra, lo que es crucial para garantizar la reproducibilidad y el éxito de los experimentos posteriores.
Tinción y clasificación de células B específicas de antígeno para el desarrollo de anticuerpos
En algunos enfoques para el desarrollo de anticuerpos, las células B específicas del antígeno se aíslan de la sangre u otros tejidos de individuos seropositivos que han encontrado el antígeno mediante infección o inmunización. En este proceso, el antígeno fusionado al Twin-Strep-tag® se puede utilizar incubándolo con:
- Conjugados fluorescentes de Strep-Tactin® o Strep-Tactin® XT.
- Microperlas magnéticas Strep-Tactin®.
- Strep-Tactin® TACS Agarosa.
Estos reactivos de selección son adecuados para la tinción y clasificación de células B específicas del antígeno mediante citometría de flujo, aislamiento magnético o cromatografía de afinidad.
Las células B que reconocen el antígeno de interés se seleccionan, por ejemplo, de células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Estas células individuales pueden ser clasificadas directamente en un tampón de lisis para su secuenciación de anticuerpos, o pueden ser cultivadas para la producción de anticuerpos. Este método para la producción de anticuerpos monoclonales ofrece la posibilidad de extraer células B y, por lo tanto, secuencias de anticuerpos directamente de humanos, mejorando así la capacidad de identificar anticuerpos que sean fácilmente adecuados para fines terapéuticos.
ELISA
En el caso del ELISA, se puede utilizar un antígeno Twin-Strep-tag® para detectar los anticuerpos. Este antígeno se puede inmovilizar en microplacas recubiertas con Strep-Tactin® XT, lo que funcionaliza la microplaca para capturar los anticuerpos presentes en, por ejemplo, sobrenadantes de células B. La detección posterior indica qué clones de células B están produciendo anticuerpos específicos. Por lo general, se necesitan varias rondas de selección para encontrar el clon con el mejor rendimiento. Dado que las microplacas recubiertas con Strep-Tactin® XT pueden regenerarse varias veces, utilizar la tecnología Strep-tag® en este proceso ahorra costes y tiempo.
Biopanning
En el método de presentación en fagos para el descubrimiento de anticuerpos monoclonales, se utiliza una biblioteca de fragmentos de anticuerpos expresados en la superficie de bacteriófagos. Para identificar los bacteriófagos que presentan fragmentos de anticuerpos que reconocen el antígeno, se utiliza un procedimiento de selección llamado Biopanning. En este proceso, los fagos se exponen a un antígeno inmovilizado, los que se unen son eluidos, amplificados y utilizados en la siguiente ronda de selección. Durante estas rondas de selección, las microplacas recubiertas con Strep-Tactin® XT y un antígeno Twin-Strep-tag® inmovilizado ofrecen un sistema reutilizable y económico similar a la detección de anticuerpos mediante ELISA. Después de identificar los fragmentos de anticuerpos que se unen específicamente al antígeno, es necesario clonar sus secuencias en anticuerpos completo para su posterior uso en investigación o aplicaciones terapéuticas. Dado que este paso puede modificar potencialmente las características de un anticuerpo, se necesitan pasos de caracterización adicionales, lo que hace que este método para el descubrimiento de anticuerpos monoclonales requiera mucho trabajo.
SPR y BLI
Los anticuerpos obtenidos mediante diferentes enfoques de descubrimiento y desarrollo de anticuerpos pueden caracterizarse aún más mediante aplicaciones de biosensores, como la resonancia de plasmón de superficie (SPR) o la interferometría de biocapas (BLI). Una vez más, el antígeno marcado con Twin-Strep es esencial en estos análisis. Debido a la afinidad picomolar de Twin-Strep-tag® por Strep-Tactin® XT, el antígeno se inmoviliza lo suficientemente bien como para permitir la determinación de la cinética de unión a un anticuerpo seleccionado. De esta manera, se identifican y seleccionan anticuerpos con las afinidades deseadas para producciones a gran escala.
Purificación de anticuerpos
Una vez identificado el mejor anticuerpo para un antígeno específico, es necesario expresarlo, por ejemplo, en un sistema de cultivo celular. Posteriormente, los anticuerpos producidos deben ser extraídos de lisados celulares, sobrenadantes de cultivos celulares o sondas biológicas. La purificación puede realizarse sin el uso de etiquetas de afinidad, mediante propiedades fisicoquímicas, la afinidad específica del antígeno o la clase de anticuerpo. Las propiedades fisicoquímicas pueden incluir el peso molecular, la carga o grupos de residuos específicos.
Dependiendo del origen de la muestra, la purificación basada en propiedades fisicoquímicas o afinidad específica del antígeno puede llevar al aislamiento de otras proteínas y anticuerpos con propiedades similares, además del anticuerpo objetivo. Por lo tanto, si se requiere obtener un anticuerpo específico con alta pureza, se recomienda la cromatografía de afinidad específica de la clase de anticuerpo, como la proteína A, que se une a las inmunoglobulinas (anticuerpos) dentro de la región Fc de su cadena pesada, independientemente de la especificidad del antígeno.
También es posible y puede resultar beneficioso elegir un procedimiento de purificación basado en etiquetas de afinidad, especialmente si el anticuerpo se va a utilizar en una inmovilización o detección posterior. Para ello, la aplicación de la tecnología Strep-tag® es altamente recomendable. El anticuerpo puede ser aislado con alta pureza simplemente utilizando una resina perfectamente adecuada para proteínas grandes, como Strep-Tactin® XT 4Flow®. Los diferentes formatos disponibles para la purificación de proteínas hacen que este sistema sea muy flexible, permitiendo adaptaciones individuales del número y tamaño de las muestras.
En resumen:
La identificación y producción de anticuerpos monoclonales (AcM) son esenciales para la investigación inmunológica, el desarrollo de terapias innovadoras y la detección de antígenos en diversos ensayos. La tecnología Twin-Strep-tag® ofrece una solución versátil y eficiente para optimizar este proceso.
Ventajas de Twin-Strep-tag®:
- Alta afinidad: La unión picomolar entre Strep-tag® y su ligando permite una purificación y detección eficiente de antígenos y anticuerpos.
- Flexibilidad: La etiqueta Strep-tag es compatible con una amplia gama de aplicaciones, desde la expresión y purificación de antígenos hasta la caracterización y producción de AcM.
- Eficiencia: Permite la integración de múltiples pasos en una sola plataforma, lo que reduce el tiempo y el costo del desarrollo de AcM.
- Escalabilidad: Los formatos de purificación disponibles permiten adaptar el proceso a diferentes necesidades.