Consejos para elegir correctamente la purificación de sondas y oligos


 

NIVELES DE PUREZA Y APLICACIONES

La síntesis de oligonucleótidos se lleva a cabo sobre un soporte sólido (vidrio de poros controlado (CPG)) en una serie de ciclos (el número de ciclos corresponde a la longitud del oligonucleótido) con cada ciclo que comprende una serie de reacciones químicas (5′-desprotección, activación/Acoplamiento, taponamiento y oxidación). Una reacción química nunca se procesa completamente. Usando la química de fosforamidita, la reacción secundaria principal es la formación de productos n-x debido a la activación incompleta o acoplamiento, respectivamente.

Cuanto más larga sea la secuencia, más productos n-x se producirán. La figura del lado derecho da una visión general de cómo el grado de la eficiencia de acoplamiento (CE) y la longitud del oligonucleótido (n) influyen en el rendimiento final del producto bruto (Rendimiento = CEn-1). Por lo tanto, el rendimiento máximo teórico de un producto de longitud completa para un 50mer con una eficiencia de acoplamiento del 99,0% será del 61% y para un 150mer con una eficiencia de acoplamiento del 98,5% sólo será del 11%, respectivamente. En general, el nivel de pureza que usted requiere depende del efecto que tendrán secuencias alternativas (n-1, n-2, … n-x productos) en su experimento específico. A continuación se ofrece un breve resumen de los diferentes niveles de purificación que Microsynth le ofrece como cliente. Además, especificamos el nivel de pureza requerido para aplicaciones que involucran oligos no modificados

OLIGONUCLEÓTIDOS DESALADOS

Todos nuestros oligos son al menos desalados para eliminar en gran medida los subproductos residuales de bajo peso molecular que surgen y se acumulan a partir de las frecuentes reacciones químicas durante la síntesis. Dicha purificación es suficiente para oligonucleótidos menores que 30 y / o oligonucleótidos usados ​​para aplicaciones no críticas tales como PCR, secuenciación, sondado, desplazamiento de movilidad o hibridación. Sin embargo, los oligos desalados no se recomiendan para el uso en proyectos de la clonación molecular.

OLIGONUCLEÓTIDOS PURIFICADOS POR HPLC

Los oligos <50 bases de longitud se purifican bien mediante HPLC de fase inversa. A través de este enfoque de purificación, se eliminan preferiblemente los oligos n-x truncados (que carecen del grupo de protección DMT hidrofóbico en el extremo 5 ‘). Esto da como resultado una pureza del 90-95% del oligonucleótido dirigido. La RP-HPLC es útil para un mayor nivel de pureza el cual es requerido para aplicaciones más exigentes tales como clonación, toma de huellas dactilares de ADN, en tiempo real, FISH, etc

OLIGONUCLEÓTIDOS PURIFICADOS POR PAGE

La purificación por electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) es generalmente necesaria para oligos largos (> 50 bases) y para todos los cebadores con secuencias 5 ‘críticas (sitios de endonucleasa de restricción, promotores de ARN). Es el mejor método para diferenciar oligos completos de secuencias abortadas (n-1 oligos), basados ​​en tamaño, conformación y carga. PAGE tiene una excelente resolución y produce un producto que es, en promedio, 95-99% puro. En este contexto, es importante observar que el nivel de pureza disminuye con el aumento de longitud del oligonucleótido, y esto es particularmente cierto para oligos> 120 bases. La purificación PAGE es altamente recomendada para experimentos sensibles tales como clonación, mutagénesis, toma de huellas de ADN, hibridación in situ, síntesis génica, etc.

CONTROL DE CALIDAD

Un riguroso sistema de control de calidad garantiza una alta calidad consistente de todos nuestros oligonucleótidos. Microsynth realiza la monitorización trityl en línea de todos los oligonucleótidos con el fin de controlar la eficiencia del acoplamiento después de cada ciclo. Después de la síntesis, la identidad molecular de nuestros oligonucleótidos se verifica mediante MALDI-TOF (hasta 50 bases) o  PAGE (51 a 150 bases) analíticas.

MANIPULACIÓN Y ALMACENAMIENTO DE OLIGONUCLEÓTIDOS DE ADN

Manejo de ADN Oligos

Cuando manipule oligonucleótidos de ADN, debe tener en cuenta lo siguiente:

  • Asegúrese de utilizar únicamente soluciones sin nucleasas (vea nuestra sugerencia a continuación para los disolventes potenciales)
  • Manipule con cuidado para evitar la contaminación bacteriana
  • Los oligos son generalmente más estables a mayores concentraciones
  • Algunos colorantes fluorescentes (especialmente colorantes Cy) son especialmente sensibles a la luz, y la exposición a la luz debe ser minimizada. Además, algunos colorantes pueden ser sensibles a la oxidación. Por lo tanto, asegúrese de que sólo abra el tubo si es necesario.

¿Cómo disolver su Oligo?

Generalmente, los oligonucleótidos se disuelven mejor en agua estéril o tampón Tris-HCl 10 mM (pH 7,5). Sin embargo, hay un par de excepciones que requieren atención especial:

  • Los oligos que llevan un colorante fluorescente no deben disolverse en agua destilada. El agua destilada por lo general tiene un pH de ~ 6,0 que favorece la degradación del colorante fluorescente. En tales casos, utilice sólo tampón Tris-HCl 10 mM a pH 7,5.
  • Los oligos que llevan colorantes fluorescentes de la familia de las cianinas como Cy3, etc. no deben disolverse en tampón Tris-HCl 10 mM a pH 7,5, ya que se degradan lentamente a pH> 7,5. En tales casos, utilice únicamente agua destilada.

¿Cómo resuspender su Oligo?

  • Hacer un spin corto a un máx. Velocidad en una centrífuga para recoger el gránulo en la parte inferior del tubo
  • Añadir una cantidad apropiada de agua estéril o tampón
  • Calentar el tubo durante 5 minutos a 65 ° C
  • Vortex o mezcle pipeteando vigorosamente hacia arriba y hacia abajo

Almacenamiento de Oligos de ADN

Si desea almacenar oligonucleótidos, considere lo siguiente:

  • Evite repetidas descongelaciones y congelaciones ya que las fuerzas físicas involucradas pueden degradar sus oligos
  • Dependiendo de su experimento, elija una condición de almacenamiento adecuada (vea nuestras sugerencias para condiciones de almacenamiento potencial más abajo)
  • La preparación de alícuotas puede tener sentido si los oligos deben almacenarse y utilizarse durante un largo período de tiempo sin perder actividad

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