La introducción de ácidos nucleicos en células por medio de técnicas como la transformación y transfección celular, ha sido y es, una herramienta muy importante en el desarrollo y avance de la ingienería genética, desde sus orígenes hasta su aplicación hoy en día, en el campo de la biotecnología y la investigación básica. Relacionado con todo ello, está el proceso de selección con el que se consigue obtener en el medio de cultivo, sólo las células que han incorporado dicho material genético, paso esencial y fundamental en el desarrollo de las técnicas. Los mecanismos de selección antibiótica y los antibióticos de selección, presentes en el medio de cultivo, permiten la identificación de células transformadas o transfectadas respecto de aquellas también presentes en el medio de cultivo no manipuladas genéticamente.
Existen, principalmente, dos técnicas de introducción del material genético en las células en cultivo, presentando ambas, un leve matiz diferencial en cuanto a su descripción. Una de ellas, es la técnica de la transformación, consistente en la introducción y expresión de material genético en células procariotas, así como, en hongos, algas y plantas. El material genético libre se incorpora en la célula receptora y genera en esta última, un cambio o transformación en su genoma, que luego se continuará durante el desarrollo de la línea celular. Para que esto ocurra, las células procariotas deben encontrarse en un estado de competencia, esto es, deben ser tratadas previamente con una solución de cloruro de calcio helada (también se pueden modificar alterando otros valores ambientales tales como: el tipo de medio de cultivo, la temperatura, la densidad celular o la concentración de nutrientes) que facilita la captación del material genético que se quiere introducir en las células. La segunda técnica es la transfección, consistente en la introducción y expresión de material genético, en este caso, en células eucariotas. Tanto transformación como transfección son métodos de introducción de ácidos nucleicos de carácter no viral, no obstante, también puede realizarse, una introducción de material genético por medios virales, conocida esta técnica como transducción, válida igualmente tanto para células eucariotas como para células procariotas.
Las técnicas de transfección y transformación pueden realizarse siguiendo métodos físicos y/o químicos. Entre los métodos químicos usados para la introducción de material genético, más habituales, encontramos la coprecitipación con fosfato cálcico, la lipofección y la presencia de complejos DEAE-dextrano (dietilaminoetil-dextrano) o del polietilenglicol. Entre los métodos físicos más habituales encontramos, la electroporación, la microinyección, la biobalística, la magnetofección, para la introducción de vectores de transformación/transfección como los plásmidos. Con todas estas técnicas, lo que se pretende es que, el material genético a introducir supere todas la barreras que la célula presenta frente a su entrada, afectando sobre todo, a la estructura de la membrana plasmática para permitir su entrada al interior de la célula, a la ruta de degradación lisosomal para evitar su expulsión al exterior celular, o a los mecanismos de translocación nuclear para permitir su entrada al interior del núcleo y su posterior introducción en el genoma celular.
Debido a la existencia de un gran número de células en los cultivos celulares, la demostración de la eficacia de la transfección y/o transformación celular realizada mediante cualquiera de los métodos descritos anteriormente, requiere la identificación o distinción entre las células que han incorporado a su genoma el material genético de interés, de aquellas que no presentan dicha incorporación. Como se puede observar, existe un proceso de selección, diseñado con el fin de favorecer el crecimiento (selección “a favor de” o positiva) de las células que contienen el material genético introducido en su genoma (células recombinantes) mientras que se evita el crecimiento (selección “en contra de” o negativa) de aquellas que no han introducido dicho material, o lo han introducido parcialmente, en su genoma.
Selección de células mediante antibióticos
Los primeros en utilizar la selección antibiótica o el uso de antibióticos como medios de selección de células, fueron Stanley Cohen, Paul Berg y Herbert Boyer quienes, a finales de los 70, consiguieron identificar las células recombinantes de aquellas no transfectadas/transformadas, mediante el cultivo o siembra de las mismas en un medio de cultivo con presencia de diversos antibióticos. Durante muchos años y aún hoy en día, la selección antibiótica ha sido un proceso muy utilizado, permitiendo con ello además de la selección, la creacción de clones o células idénticas con copias, en todas las células seleccionadas, del material genético introducido por medio de la técnica de transformación y transfección. Es necesario indicar respecto a este proceso, que para permitir la selección positiva-negativa, es necesario introducir conjuntamente al material genético de interés, genes de resistencia a los diversos antibióticos de selección para que, así se genere, sobre las células que introducen el material genético en su genoma, una supervivencia frente a dicho antibiótico de selección dispuesto en el medio de cultivo. Se pueden eliminar por medio de la recombinación genética, para permitir la realización de una manipulación genética secuencial posterior.
Los antibióticos más habitualmente utilizados en la selección antibiótica, son generalmente antibióticos no utilizados en la práctica clínica o que han ido presentando fallos en la misma, a lo largo del tiempo. De los más conocidos destacan la blasticidina, la higromicina-B, la puromicina o la G418. La empresa InvivoGen a través de su distribuidora Ibian Technologies, comercializa estos antibióticos así como la fleomicina y la zeocina. A continuación se describen con más detalle las características de estos antibióticos de selección comercializados por Ibian Technologies:
Antibióticos de selección para células eucariotas y procariotas:
InvivoGen produce antibióticos de selección de un nivel de pureza sin igual, su alta calidad y su precio competitivo hacen que los antibióticos de selección estén entre los productos más demandados de la casa InvivoGen. Todos los antibióticos de InvivoGen son estables, han sido testados en cultivo, y se suministran listos para su uso.
Blasticidina
Es un antibiótico peptidil-nucleótido aislado de un cultivo de Streptomyces griseochromogenes, cuya función es la de inhibir la síntesis de proteínas en células eucariotas y procariotas (altera la terminación de la traducción y/o formación del enlace peptídico). En investigación básica, se usa para para seleccionar y/o establecer líneas celulares estables que han introducido un gen de resistencia a la blasticidina, gen bsr y BSD, que codifica para la síntesis de blasticidin deaminasa, procedentes respectivamente de B. cereus y A. terreus. La selección positiva se produce por la generación en las células transformadas/transfectadas, de la proteína blasticidin-deaminasa a pesar de la presencia de blasticidina en el medio de cultivo.
Aunque la blasticidina se usa sobre todo para la selección de células de mamíferos, también resulta útil para la selección de E. coli. Para células de mamíferos, se requiere de cantidades de 1-10 μg/ml o 30 μg/ml en algunos casos (línea celular PC1.0 de hámster) y de una determinación inicial de la concentración óptima de antibiótico; en cuanto a tiempo, son necesarios 7 días para las selección de las células transfectadas. Para E.coli, al ser menos sensible, se requiere más cantidad de antibiótico en el medio de cultivo (100 μg/ml) y más tiempo para completar la selección celular.
Contenido:
Se suministra en tubos de 1 ml de volumen con una solución de buffer HEPES incolora, a concentración final de 10 mg/ml, pH 7.5, filtrado y esterilizado.
– ant-bl-1: 10 x 1 ml at 10 mg/ml (100 mg)
– ant-bl-5: 50 x 1 ml at 10 mg/ml (500 mg)
– ant-bl-5b: 1 x 50 ml at 10 mg/ml (500 mg)
Almacenaje y estabilidad: Se envía a temperatura ambiente. Temperatura de almacenaje: 4ºC y -20ºC.
Control de calidad: Su grado de pureza controlado por HPLC, es mayor al 95%. Su actividad está controlada mediante bioensayos en bacterias y líneas celulares de mamífero.
Recomendaciones (selección de células de mamífero)
Los antibióticos funcionan mejor cuando las células se están dividiendo activamente. Si se alcanza una elevada densidad celular, la eficiencia del antibiótico disminuirá. Se considera una densidad óptima para la eficacia del antibiótico de selección, aquella igual al 25% de la densidad total.
Remover y reemplazar los antibióticos presentes en el medio cada 3 – 4 días.
Higromicina-B Gold:
Es un antibiótico aminoglucósido producido por Streptomyces hygroscopius, originalmente desarrollada para un uso veterinario. Hoy en día, es un antibiótico usado universalmente para la selección y mantenimiento de células tanto eucariotas como procariotas que portan el gen hph(sintetiza una quinasa que fosforila el propio antibiótico). La higromicina-B Gold elimina células eucariotas, procariotas y ciertos hongos al provocar la inhibición de la síntesis proteica (efecto dual sobre la traducción del RNAm, alteración de la lectura de codones o del centro de decodificación). Se utiliza para experimentos de genética molecular de numerosas especies procariotas y eucariotas.
La mayoría de las células con crecimiento aeróbico son eliminadas en presencia de higromicina-B Gold en el medio de cultivo, en un rango de concentraciones de 50-500 μg/ml, su sensibilidad es dependiente del valor de pH del medio de cultivo; a mayor valor de pH, mayor sensibilidad. Para la selección de E. coli se requieren cantidades de 50-100 μg/ml; para la selección de células de mamífero se requieren cantidades de 50-200 μg/ml a en ciertos casos, 500 μg/ml. En este último caso, y dependiendo de la línea celular, se alcanzará la selección total de células transfectadas, entre los 10 días a las 3 semanas posteriores al tratamiento.
Contenidos
Se suministra en volúmenes de 1ml o de 50 ml, en solución de color amarillo con concentración final igual a 100 mg/ml en buffer HEPES, pH 7.0, filtrada y esterilizada.
– ant-hm-1: 10 x 1 ml at 100 mg/ml (1 g)
– ant-hm-5: 1 x 50 ml at 100 mg/ml (5 g)
Almacenaje y estabilidad: Se envía a temperatura ambiente y una vez recibido, debe ser almacenado a 4ºC o a -20ºC. Es estable a temperatura ambiente durante 3 meses. Evitar los ciclos de congelación-descongelación.
Control de calidad: Su grado de pureza controlado por HPLC, es mayor al 85%. Su actividad está controlada mediante bioensayos en bacterias y líneas celulares de mamífero.
Recomendaciones (selección de células de mamífero)
La higromicina B es sensible a las altas concentraciones de ácido, pero a corto plazo, la exposición a ácidos diluidos reduce la sensibilidad hasta un grado tolerable.
Los antibióticos funcionan mejor cuando las células se están dividiendo activamente. Si se alcanza una muy elevada densidad celular, la eficiencia del antibiótico, disminuirá. Se considera una densidad óptima para la eficacia del antibiótico de selección igual al 25% de confluencia celular.
Remover y reemplazar los antibióticos presentes en el medio cada 3-4 días.
Puromicina:
Es un antibiótico aminonucleósido producido por Streptomyces alboniger, con amplio espectro de actuación; sobre células procariotas, eucariotas, hongos, protozoos y amebas. Inhibe el crecimiento de bacterias Gram positivas y varias tipos de células animales y de insectos; las bacterias Gram negativas y los hongos, no obstante, son resistentes debido a la baja permeabilidad que presentan al antibiótico. Su mecanismo de acción principal es inhibir la síntesis de proteínas, actuando sobre la transferencia de los péptidos y consecuentemente, provocando una liberación de la cadena polipéptidica prematuramente.
Se utiliza en biología molecular (estudio de la síntesis de proteínas) como agente selectivo de células, a través de la presencia del gen pac (sintetiza por la puromicina N-acetil-transferasa, vinculado a otros genes para la biosíntesis de puromicina en cepas de S. alboniger) en el genoma de las células de mamífero transfectadas (en el caso de E.coli, esto sólo tiene lugar en casos muy especiales).
La puromicina es muy poco activa frente a la selección de E. coli; se requiere un ajuste preciso del pH y también depende de qué cepa bacteriana se haya seleccionado. Para una selección sin problemas y con resultados óptimos, es posible que sea necesario el uso de una puromicina especial y modificada.
Para células de mamíferos, sí que es un antibiótico de selección muy útil y puede ser considerado como un antibiótico alterantivo a la neomicina en la transfección celular. En este caso, las concentraciones de trabajo más habituales se encuentran en un rango de 1-10 μg/ml y la selección de las células transfectadas es muy fácil y rápida (tiempo requerido de 2 días para la selección total de las células transfectadas).
Contenidos:
Se suministra en tubos de 1 ml de volumen a concentración final igual a 10 mg/ml en buffer HEPES (producto activado 100%), filtrado y esterilizado.
– ant-pr-1: 10 x 1 ml at 10 mg/ml (100 mg)
– ant-pr-5: 50 x 1 ml at 10 mg/ml (500 mg)
– ant-pr-5b: 1 x 50 ml at 10 mg/ml (500 mg)
Almacenaje y estabilidad: Se envía a temperatura ambiente y una vez recibido, debe ser almacenado a 4ºC o a -20ºC. Es estable a temperatura ambiente durante 3 meses. Evitar los ciclos de congelación-descongelación.
Control de calidad: Su grado de pureza controlado por HPLC es mayor al 95%. Su actividad está controlada mediante bioensayos en bacterias y líneas celulares de mamífero.
Recomendaciones (selección de células de mamífero)
Los antibióticos funcionan mejor cuando las células se están dividiendo activamente. Si se alcanza una muy elevada densidad celular, la eficiencia del antibiótico, disminuirá. Se considera una densidad óptima para la eficacia del antibiótico de selección igual al 25% de confluencia celular.
Remover y reemplazar los antibióticos presentes en el medio cada 3-4 días.
Fleomicina:
Es un antibiótico metalo-glucopeptídico de la familia de las bleomicinas, isolado de una cepa mutante de Streptomyces verticillus activo frente la mayoría de bacterias, hongos filamentosos, levaduras; resulta tóxico sobre células animales y vegetales. Su mecanismo de acción es provocar roturas en la cadena del ácido nucleico tanto en condiciones in vitro como in vivo; en las cadenas bicatenarias se une en zonas metiladas, en las monocatenarias se une a secuencias repetidas e invertidas. La fleomicina también actúa sobre las membranas plasmásticas provocando ciertas alteraciones en su andamiaje. La selección antibiótica se ejerce por la presencia en el genoma de la célula transformada/transfectada del gen Sh ble, que sintetiza una proteína con alta afinidad de unión a la fleomicina, provocando la inhibición de la actividad recortante que, sobre el ácido nucleico, ejerce el antibiótico.
Esta proteína no resulta tóxica para una amplia mayoría de células, lo cual permite que, a una mayor expresión génica del gen Sh ble, aumente la resistencia a la fleomicina y con ello, la eficacia en la selección de células. Estructuralmente, se trata de un complejo de antibióticos relacionados entre sí, que se diferencian por la presencia de residuos de amina en posición terminal. La fleomicina se encuentra quelada a una molécula de cobre, causante de la coloración azul de la solución del antibiótico de selección.
La mayoría de células con crecimiento aeróbico son eliminadas por acción de la fleomicina a concentraciones de ésta iguales a 0,1 a 50 μg/ml. Sin embargo, la sensibilidad de las células al antibiótico es dependiente del pH; cuanto mayor sea el pH del medio de cultivo, mayor será la sensibilidad al antibiótico. Además , la actividad de la fleomicina se reduce al aplicar un factor 2/50 de solución hipertónica como las que se usan en la regeneración de los protoplastos; a menos concentración de sales en la solución, menor será la cantidad de fleomicina necesaria a introducir en el medio de cultivo, para llevar a cabo la selección de las células. Se recomienda el uso de fleomicina como antibiótico de selección para células de levadura y hongos filamentosos de muy baja sensiblidad a la zeocina.
a) Selección de E. coli → las cepas más comunes (e.j. HB101, DH5a, MC1061) cuyas células bacterianas hayan sido transformadas, son resistentes a fleomicina. En estos casos, sólo requieren de 5 μg/ml de fleomicina para llevar a cabo la selección, permaneciendo estables las células transformadas seleccionadas por este modo, durante 1 mes a 4ºC.
b) Selección de levaduras → las células de levadura se transfectan seguiendo los protocolos habituales, utilizando un medio YPED a pH igual a 7.0, suplementado con una concentración de fleomicina igual a 10 μg/ml.
c) Selección de hongos → se requiere una concentración de fleomicina igual a 10-50 μg/ml (puede variar dependiendo de la sensibilidad observada) en el medio de regeneración, para realizar la selección celular, aumentando su eficacia si previamente 12 horas antes de la selección antibiótica, se incuban las células transformadas a 4ºC de temperatura.
d) Selección de células vegetales → aunque depende bastante del tipo de vegetal a transfectar, la concentración de fleomicina requerida para la selección de este tipo celular se encuentra en un rango entre 5-25 μg/ml de fleomicina.
e) Selección de células de mamífero → los rangos de concentración utilizados para la selección mediada por la fleomicina están entre 5 a 50 μg/ml y el tiempo requerido para la selección de las células transfectadas puede requerir entre los 5 días a las 3 semanas.
Contenidos
Se suministra en tubos de 1 ml a botellas de 25 ml de volumen, en un solución de color azul de concentración final igual a 20 mg/ml, filtrada y esterilizada.
– ant-ph-1: 5 x 1 ml at 20 mg/ml (100 mg)
– ant-ph-5: 25 x 1 ml at 20 mg/ml (500 mg)
– ant-ph-5b: 1 x 25 ml at 20 mg/ml (500 mg)
Almacenaje y estabilidad: Se envía a temperatura ambiente. Almacenamiento: 4ºC – (-20ºC). Estabilidad: 18 meses a -20ºC, 12 meses a 4ºC, 1 mes a temperatura ambiente. Evitar los ciclos de congelación-descongelación.
Control de calidad: Su grado de pureza controlado por HPLC es mayor al 90%. Su actividad está controlada mediante bioensayos en bacterias y líneas celulares de mamífero.
Recomendaciones
Se inactiva fácilmente por el pH ácido o básico así como por la presencia de hipoclorito sódico.
La fleomicina es sensible a las altas concentraciones de ácido, pero a corto plazo, la exposición a ácidos diluidos reduce la sensibilidad hasta un grado tolerable.
Zeocina:
Se trata de una formulación especial que contiene feomicina D1 (la zeocina es un antibiótico glucopeptídico, análogo a la fleomicina) con quelación de cobre, aislado de un cultivo de una cepa mutante de S. verticillus. Al igual que la fleomicina, pertenece a la familia de las bleomicinas. Presenta un amplio espectro frente a microorganismos eucarióticos, células vegetales y animales. Su mecanismos de acción se basa, al igual que la fleomicina, en la unión y posterior degradación de las cadenas de ácidos nucleicos. La selección antibiótica se realiza mediante la presencia en el genoma de las células transfectadas del gen Sh ble, (codifica para la misma proteína con la misma función inhibitoria, que la que se observa en la fleomicina) alcanzándose una selección óptima tanto en células de mamífero como en procariotas por presencia de ese gen de resistencia en el vector usado en la transfección o transformación. Se trata entonces, de un antibiótico de selección para la identificación y selección de células resistentes a otros antibióticos de selección, como G418, higromicina – B, blasticidina o puromicina.
Estructuralmente, se trata de un complejo de antibióticos relacionados entre sí, que se diferencian por la presencia de residuos de amina en posición terminal. La zeocinaTM se encuentra quelada a una molécula de cobre, causante de la coloración azul de la solución.
La mayoría de células con crecimiento aeróbico son eliminadas ante la presencia de zeocinaTM en rangos de concentración entre 0,5 a 1.000 μg/ml. Sin embargo, la sensibilidad de las células al antibiótico es dependiente del pH; cuanto mayor sea el pH del medio de cultivo, mayor será la sensibilidad al antibiótico. Además, la actividad de la zeocinaTM se reduce al aplicar un factor 2/3 de solución hipertónica como las que se usan en la regeneración de los protoplastos; a menos concentración de sales en la solución, menor será la cantidad de fleomicina necesaria a introducir en el medio de cultivo, para llevar a cabo la selección de células transfectadas.
– Selección en E. coli → las cepas más comunes de E. coli (e.j. HB101, DH5a, MC1061) transformadas mediante el uso de vectores diseñados por InvivoGen conteniendo promotores sintéticos de E.coli como EM7 y los genes de resistencia Sh ble, son resistentes a la zeocinaTM. ¡ATENCIÓN! No use cepas de E.coli “MC1066» que contienen el transposón Tn5 pues, debido a la resistencia a la bleomicina que codifica, genera una mayor resistencia a la zeocinaTM. Para la selección antibiótica de estas células se requiere un suplementación del medio de 25 μg/ml. La estabilidad máxima de estos cultivos tiene lugar durante 1 mes si se mantiene a 4ºC.
– Selección en células de mamíferos → la concentración habitual de trabajo para la selección de células de mamíferos, varía de 50 to 400 μg/ml, siendo en algunos casos tan baja como 20 μg/ml
o tan alta como 1000 μg/ml. A mayor densidad celular, mayor será la rapidez de individualización y/o capacidad de diferenciación de la zeocinaTM siendo habitual, un intervalo de tiempo requerido entre 5 días a 3 semanas.
Contenidos
Se suministra en tubos de 1 ml o botellas de 50 ml de volumen a concentración final igual a 100 mg/ml (producto activado 100%), buffer HEPES, pH 7.25, filtrado y esterilizado.
– ant-zn-1: 10 x 1 ml at 100 mg/ml (1 g)
– ant-zn-5: 50 x 1 ml at 100 mg/ml (5 g)
– ant-zn-5b: 1 x 50 ml at 100 mg/ml (5 g)
Almacenaje y estabilidad: Se suministra a temperatura ambiente; una vez recibida, debe almacenarse a 4ºC o a -20ºC. Estabilidad: 18 meses a -20ºC, 12 meses a 4ºC y 1 mes a temperatura ambiente. Evitar los ciclos de congelación-descongelación.
Control de calidad: Su grado de pureza controlado por HPLC es mayor al 90%. Su actividad está controlada mediante bioensayos en bacterias.
Recomendaciones
La zeocinaTM es sensible a las altas concentraciones de ácido, pero a corto plazo, la exposición a ácidos diluidos reduce la sensibilidad hasta un grado tolerable.
Los antibióticos funcionan mejor cuando las células se están dividiendo activamente. Si se alcanza una muy elevada densidad celular, la eficiencia del antibiótico, disminuirá. Se considera una densidad óptima para la eficacia del antibiótico de selección igual al 25% de confluencia celular.
Remover y reemplazar los antibióticos presentes en el medio cada 3-4 días
G418:
Es un antibiótico aminoglucósido con una estructura similar a la gentamicina B1, producido por Micromonospora rhodorangea. A diferencia de la gentamicina, G418 bloquea la síntesis de polipéptidos en células eucariotas por medio de la unión irreversible a la subunidad mayor del ribosoma, interrumpiendo la correcta síntesis proteica. La selección antibiótica se produce por medio de la presencia en el genoma de las células transfectadas de genes neo, presentes en el transposón Tn5, que codifica por la proteína APH 3′ II (aminoglucósido 3- fosfotransferasa) que inactiva al antibiótico G418 por la unión convalente al dominio amino y al dominio hidroxilo de su estructura peptídica y con ello, inhibe también las uniones irreversibles del antibiótico a la subunidad mayor del ribosoma. Se trata de un antibiótico de selección y mantenimiento de células transfectadas y/o transformadas.
No hay una concentración o rango de trabajo de la G418 fijo para la selección de células transfectadas pues depende de múltiples factores; pueden realizarse experimentos con concentraciones variables desde 100 µg/ml a 1 mg/ml. No obstante la selección de células es bastante rápida, requeriendo sólo 7 días para la obtención de las células transfectadas individualizadas. Para células de mamífero se recomienda una concentración de trabajo de aproximadamente 400 µg/ml para la selección y 200 µg/ml para el mantenimento (pueden aumentar o disminuir según la línea celular de la que procedan las células) pero nunca superior a 1 mg/ml.
Contenido
Se suministra en solución de concentración final igual a 100 mg/ml, con agua, filtrada y esterilizada.
– ant-gn-1: 10 x 1 ml at 100 mg/ml (1 g)
– ant-gn-5: 1 x 50 ml at 100 mg/ml (5 g)
Almacenaje y estabilidad: Se envía a temperatura ambiente y tras la recepción se puede almacenar a 4ºC. Las condiciones de almacenamiento óptimo se alcanzan a temperatura de – 20ºC .
Control de calidad: Su actividad está controlada mediante bioensayos en bacterias.
Recomendaciones:
Los antibióticos funcionan mejor cuando las células se están dividiendo activamente. Si se alcanza una muy elevada densidad celular, la eficiencia del antibiótico, disminuirá. Se considera una densidad óptima para la eficacia del antibiótico de selección igual al 25% de confluencia celular.
Remover y reemplazar los antibióticos presentes en el medio cada 3-4 días.
